Раздел IV. Методы анализа в регенеративной медицине

Глава 1. Визуализация клеточных культур и тканеинженерных конструктов

1.1. Фазово-контрастная, флуоресцентная и электронная микроскопия

Визуализация клеточных структур и сформированных с их использованием конструкций является неотъемлемой частью их исследования. Основной принцип визуализации заключается в детекции частиц после взаимодействия пучка частиц с объектом исследования, а основной инструмент визуального анализа — микроскоп. В зависимости от источника излучения частиц наиболее распространенные микроскопические системы разделяют на световые, лазерные, электронные и рентгеновские. Отдельной группой являются зондовые микроскопы, где визуализация происходит за счет формирования туннельного тока или силового взаимодействия между поверхностью объекта и зонда. В данной главе они рассмотрены не будут.

Ключевую роль в визуализации клеток для решения рутинных задач в современной клеточной биологии и тканевой инженерии играет световая микроскопия. В световой микроскопии частицы, взаимодействующие с объектом исследования, — это фотоны света, в качестве источника освещения, как правило, выступают галогенные или ртутные лампы.

Базовым методом световой микроскопии является метод светлого поля в проходящем свете. Ключевыми компонентами такого микроскопа для визуализации являются источник света, конденсор, объектив и окуляры. Пример устройства стандартного микроскопа и схема его оптического пути приведены на рис. 1.1.

Рис. 1.1. Устройство прямого светового микроскопа (А) и оптический путь частиц света в нем (Б)

От источника освещения свет собирается в линзе коллектора и далее проходит через конденсор, который позволяет отрегулировать положение пучка и его толщину за счет центровки и апертурной диафрагмы, после чего свет попадает на объект исследования и затем через объектив в окуляр — на сетчатку глаза или детектор фотокамеры для получения изображения. Ширина анализируемого поля регулируется с помощью полевой диафрагмы.

Для получения корректного изображения может потребоваться настройка освещения микроскопа по методу Келлера за счет фокусировки и центровки изображения полевой диафрагмы.

Основной характеристикой любой системы визуализации является ее разрешающая способность — способность к изображению близко расположенных точек объекта как отдельно различимых. Предел разрешения микроскопа (разрешение) — это минимальное расстояние, при котором 2 точки объекта различимы как отдельные. Чем меньше это расстояние, тем выше разрешающая способность микроскопа. Разрешение (R) вычисляется по формуле:

,

где λ — длина волны используемого света, NA — числовая апертура объектива или конденсора, которая определяется формулой:

NA = n×sinα/2,

где n — коэффициент преломления оптической среды между объективом и покровным стеклом, α — угол раскрытия объектива/конденсора.

При настройке апертуры конденсора равной апертуре объектива формула вычисления упрощается до:

.

Числовая апертура объектива микроскопа — это мера его способности собирать свет в фиксированных условиях. Увеличение апертуры объектива и, как следствие, разрешающей способности микроскопа возможно за счет увеличения коэффициента преломления оптической среды n, который в воздушной среде равен 1. Для этого используют иммерсию — погружение объектива в жидкость с другим коэффициентом преломления (для воды n = 1,33, для масла n = 1,51).

Другой важной характеристикой визуального анализа является увеличение микроскопа, при котором идет построение изображения. Различают общее (оптическое) увеличение микроскопа и геометрическое. Общее увеличение V равно произведению коэффициентов всех увеличивающих или уменьшающих линз микроскопа, в основном объектива и окуляров:

V = V objective × V ocular.

Геометрическое увеличение G подсчитывают при фоторегистрации изображения с помощью камеры и выводе его на экран монитора с помощью умножения оптического увеличения объектива (V objective), оптического увеличения адаптера камеры (V camera) и отношения диагонали монитора (D monitor) к диагонали матрицы камеры (D camera):

G = V objective × V camera × (D monitor / D camera).

Следует также учитывать глубину резкости объектива (глубину фокуса) — расстояние вдоль оптической оси светового микроскопа, в пределах которого обеспечивается возможность наблюдения резкого изображения точек, находящихся от него на разном расстоянии, в одном оптическом поле. Она зависит от увеличения микроскопа и апертуры объектива. При малых увеличениях и малой апертуре глубина резкости больше, чем при больших увеличениях.

,

где NА — апертура объектива, V — увеличение микроскопа, λ — длина волны.

В микроскопии проходящего света в светлом поле контраст образца главным образом создается вследствие разных уровней поглощения света — благодаря окрашиванию или собственной пигментации. Для образцов с недостатком естественной разницы во внутреннем поглощении света, без существенной трехмерной рельефной структуры, таких как живые клетки, полученное изображение обладает слабым контрастом, можно увидеть лишь общие очертания объекта (рис. 1.2, А).

Для получения изображений прозрачных и бесцветных образцов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля, были разработаны методы оптического контрастирования. Один из наиболее базовых и распространенных подходов среди них — это метод фазового контраста. В его основе лежит явление интерференции волн света (2 световые волны, фазы колебаний которых совпадают, усиливаются, в то время как при отличии фазы на 1/2 длины волны происходит полное гашение). Даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (примерно –1/4 длины волны). Это изменение не воспринимается глазом, поэтому в схему микроскопа или объектив встроена так называемая «фазовая пластинка» — полупрозрачное кольцо с напылением, которое создает разную пропускную способность пластинки. Свет, не рассеянный и отраженный препаратом, точно попадает на фазовую пластинку, которая смещает фазу света на +1/4 длины волны. Таким образом, между рассеянным препаратом светом и светом, не взаимодействовавшим с образцом, создается разница фаз в 1/2 длины волны, что приводит к полному гашению. Это означает, что детали клетки кажутся темными на более светлом фоне (рис. 1.2, Б).